DNA 복제, 플라스미드, Agarose Gel Electrophoresis

  DNA Cloning (DNA 복제)  

 

Basic Steps required to clone a gene -  

 

1. A fragment of DAN containing the gene to be cloned is inserted, usually with the use of retriction enzymes (제한효소) and ligation enzymes (enzymes that covalentaly joi DNA fragment toghether), into a DNA molecule called a vector to produce a recombinant DNA molecule. This vector usualy exists as a circular DNA, but is linerized with the use of retriction enzymes during the early stages of cloning process.  

 

2. The Vector acts as a vehicle to transport the gene into a host cell, which is often a bacerium, although other types of living cells can be used.  

 

3. Within the host cell the vector multiplies, producing many identical copies of the vector and the gene that it carries.

 

4. When the host cell divides, copies of the recombinant DAN molecules are passed to the progeny and further vector replication takes place.

 

5. After a large number of cell divisions, a clony, or clone, of the identical host cells is produced. Each cell in the clone contains copies of the recombinatn DNA molecul; the gene carreid by the recombinatn molecule is now said to be cloned.

 

 

 

Vector의 특징으로 -    

host cell에서 독립적으로 복제할 수 있고, vector를 절단하고 새로운 DNA와 결합되도록 제한효소의 인식하며, host cell에서 자신의 존재를 알리기도 한다. 그 예로 Plasmid (박테리아나 이스트에서 발견되며 작은 원으로 된 DNA다), Viral nucleic acids 등이 있다.  

 

 

플라스미드(plasmid) 사용 -

간단하게 다시 정리하자면, 플라스미드는 박테리아 안에 있는 원형으로된 작은 DNA인데, 플라스미드에 원하는 DNA를 넣고 그 플라스미드를 어떤 박테리아에 넣으면 그 박테리아가 계속 세포분열을 해서 많은 유전자를 얻을 수 있다.

 

 

 

 

Plasmid mapping은 플라스미드에 제한효소를 임의적으로 넣어, 나오는 잘려진 조각을 보고 길이를 계산해서 대략적으로 표시한것이다.

정기영동으로는 정확한 길이까지 잘 알 수 없기에 어떤 제한효소가 어느곳을 자를지 예상하는것이다. 정확하게는 sequencing을 하면 된다.

 

 

   Agarose Gel Electrophoresis, 전기영동 

+ charged molecules는 - charged electrode로 움직일것이고 (cathode) - charged molecules는 + charged electrode (anode)로 이동하는 원리를 활용한것이다. DNA나 RNA는 sugar-phosphate backbone(인산기)때문에 음전하를 띄게되어 + electrode로 움직이게 된다.

DNA의 길이가 짧은것은 + 전극으로 많이가고, DNA 길이가 긴것은 더 적게 간다. 그러면 DNA가 이동한 위치가 길이에 따라 다르게 배치되는데 이 상태에서 형광물질을 입혀서 DNA를 확인한다. 

그림으로 더 설명해보자면~~ 

 

 

이때 molecule의 이동은 세 가지에 따라 이동거리가 달라진다. 사이즈, 모양, 그리고 charge-mass ratio. DNA 분자는 모양이 같고 비슷한 charge-to-mass ratio를 가지고 있다. 따라서 DNA나 RNA의 "사이즈"에 따라 이동거리가 달라지게 된다.  Agarose gel에서 Agarose 함유된 양이 많을수록 DNA 움직임이 느리다. 작은 DNA fragment일수록 빨리 움직이기에 Agarose 양을 높여 DNA 움직임을 늦출 수 있다. 

 

아래 그림보니 더 편하다. 출처는

http://blog.naver.com/sooniebbunya?Redirect=Log&logNo=10029418253