생물학, 통계학, 데이터 과학

  DNA Cloning (DNA 복제)  

Basic Steps required to clone a gene -  

1. A fragment of DAN containing the gene to be cloned is inserted, usually with the use of retriction enzymes (제한효소) and ligation enzymes (enzymes that covalentaly joi DNA fragment toghether), into a DNA molecule called a vector to produce a recombinant DNA molecule. This vector usualy exists as a circular DNA, but is linerized with the use of retriction enzymes during the early stages of cloning process.  

2. The Vector acts as a vehicle to transport the gene into a host cell, which is often a bacerium, although other types of living cells can be used.  

3. Within the host cell the vector multiplies, producing many identical copies of the vector and the gene that it carries.

4. When the host cell divides, copies of the recombinant DAN molecules are passed to the progeny and further vector replication takes place.

5. After a large number of cell divisions, a clony, or clone, of the identical host cells is produced. Each cell in the clone contains copies of the recombinatn DNA molecul; the gene carreid by the recombinatn molecule is now said to be cloned.

Vector의 특징으로 -    

host cell에서 독립적으로 복제할 수 있고, vector를 절단하고 새로운 DNA와 결합되도록 제한효소의 인식하며, host cell에서 자신의 존재를 알리기도 한다. 그 예로 Plasmid (박테리아나 이스트에서 발견되며 작은 원으로 된 DNA다), Viral nucleic acids 등이 있다.  

플라스미드(plasmid) 사용 -

간단하게 다시 정리하자면, 플라스미드는 박테리아 안에 있는 원형으로된 작은 DNA인데, 플라스미드에 원하는 DNA를 넣고 그 플라스미드를 어떤 박테리아에 넣으면 그 박테리아가 계속 세포분열을 해서 많은 유전자를 얻을 수 있다.

Plasmid mapping은 플라스미드에 제한효소를 임의적으로 넣어, 나오는 잘려진 조각을 보고 길이를 계산해서 대략적으로 표시한것이다.

정기영동으로는 정확한 길이까지 잘 알 수 없기에 어떤 제한효소가 어느곳을 자를지 예상하는것이다. 정확하게는 sequencing을 하면 된다.

   Agarose Gel Electrophoresis, 전기영동 

+ charged molecules는 - charged electrode로 움직일것이고 (cathode) - charged molecules는 + charged electrode (anode)로 이동하는 원리를 활용한것이다. DNA나 RNA는 sugar-phosphate backbone(인산기)때문에 음전하를 띄게되어 + electrode로 움직이게 된다.

이때 molecule의 이동은 세 가지에 따라 이동거리가 달라진다. 사이즈, 모양, 그리고 charge-mass ratio. DNA 분자는 모양이 같고 비슷한 charge-to-mass ratio를 가지고 있다. 따라서 DNA나 RNA의 "사이즈"에 따라 이동거리가 달라지게 된다.  Agarose gel에서 Agarose 함유된 양이 많을수록 DNA 움직임이 느리다. 작은 DNA fragment일수록 빨리 움직이기에 Agarose 양을 높여 DNA 움직임을 늦출 수 있다. 

아래 그림보니 더 편하다. 출처는

http://blog.naver.com/sooniebbunya?Redirect=Log&logNo=10029418253  

Restriction Enzyme (제한효소)

DNA를 조작하기위해, 원하는 부위의 DNA를 자를 수 있어야한다. 제한효소(Restriction Enzyme)는 특정염기서열을 인식해서 자를수 있기때문에 이를 활용한다. 제한효소에서 Type I, II, III 이렇게 분류를 하는데, type I과 type III은 인식부위가 아닌 다른 곳의 DNA를 절단하기때문에 막상 DNA 실험(gene cloning)에 적합하지 않아서 type II를 사용한다.  

이때, 제한효소의 type II가 인식하는 염기서열을 회문성염기라고 하는데 여기서 회문(palindrome)이란.. 내이름은 이효리~ 거꾸로 해도 이효리..라는 것처럼 앞뒤로 읽었을때 똑같이 읽을 수 있는 단어나 문장을 말한다. 

위에 그림을 보면, 두 개의 선으로 되어있는게 DNA를 뜻하고 G, A, T, C는 염기서열이다. 노락색 박스, 파란색 박스가 바로 제한효소가 인식하는 회문성염기인데, 그중에서 각 제한효소마다 자르는 부위가 다르다.

이때 어떻게 자르느냐에 따라, Sticky end, Blent end라고 한다. Sticky end 사진을 보면 잘려진 DNA가 지그재그로 잘려있는걸 알 수 있는 반면, Blent end의 잘려진 DNA는 일자로 잘려있음을 알 수 있다.  이렇게 잘려진 모양에 따라 구분하면 된다. Sticky end 그림을 보면 잘려진부위가 5' 가 튀어나왔으면 5' overhangs, 3'이 튀어나왔으면 3' overhangs라 한다

제한효소 예시는 다음 아래 그림과 같다 :)

그렇다면 재미있는 질문~

박테리아가 제한효소를 만든다면 왜 박테리아 자신의 DNA를 자르지는 않는걸까? 

- 제한효소를 가지는 이유는 특정 바이러스 DNA에 대한 방어기질로 외부 DNA가 침입했을때, 이를 절단하기 위해서다. 하지만 자신의 DNA도 자를 수 있기때문에 박테리아는 DNA methylases (modification enzymes)를 만든다. 즉, 세포에서 제한효소를 만들어낼때 자신의 DNA 절단을 막기위해 메틸화효소를 만들어, 자신의 DNA가 복제될 때 제한효소자리에 있는 특정염기 안에, 혹은 근처에 메틸기를 첨가한다. 이 제한효소는 메틸기를 인식해서 절단하지 않는다. 그걸 메틸화(Methylation)이라 한다.

Why bacteria have evolved a restriction/modification system?

- Some virus have evolved ways of subverting the restriction modification system, usally by modifying their own DNA, by adding methyl or glycosyl group to it, thus blocking the restriction enzymes. To counteract these viruses, some bacteria have evolved retriction systems which only recognize and cleave modified DNA , but do not act upon the hot's unmodified DNA. some prokaryotes have develped multiple types of restriction modificatio systems.

reference:  http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_modification_system  

 Restriction Mapping  

정체를 알 수없는 DNA에서 제한효소 절단부위에 대한 상대적인 위치를 찾아내는 과정을 말한다. 즉, Restriction Enzyme의 특정위치를 자르는 특성을 활용해 잘라진 DNA 부분(fragment) 크기를 전기영동(Electrophoresis)를 통해 찾아내는것이다. 

DNA 여러종류의 restriction enzyme을 처리한 후, 절단된 단편을 이용해 DNA의 map을 얻을 수 있는 방법혹은 DNA의 잘라진면을 end-labeling하여 electrophoresis로 분리한 후 partial digestion하는 방법이 있다.  

>> DNA 손상(Unzipping the helix)

이중나선 DNA에다가 온도를 높이거나 pH 높이면 두 가닥에서 한 가닥으로 denature하게 된다.하지만 다시 온도를 낮추거나, pH를 낮추게 되면 원래의 DNA 이중나선으로 돌아오기 때문에 DNA의 손상 및 재결합은 reversible하다!  

참고로 온도를 천천히 낮춰야하지 빠르게 온도를 낮추게 될 경우, 완벽하게 돌아오지 않을 수 있다. 온도를 통한 denature는 염기(bases)간의 수소결합을 방해하기 때문에 한 가닥으로 떨어지게 되는 것이다. 이때 온도는 Tm이라 부르는데, 즉 melting temperature를 뜻하며 각 생물마다 두 가닥에서 한 가닥으로 떨어져나갈때의 온도는 다르다.    

Q. 둘 중 어느 쪽 결합이 더 높은 Tm을 가질까?

1) 5’-AAATT-3’ / 3’-TTTAA-5’          2) 5’-GGGCT-3’ / 3’-CCCGA- 5’ 

풀이) 저번 포스팅에서 살펴보았듯이 bases끼리 수소결합을 통해 DNA 가닥끼리 연결하게 되는데 A(adenine)는 T(Thymine)과 2개의 수소결합을, G(guanine)은 C(Cytosine)과 3개의 수소결합을 한다. 이때 3개의 수소결합이 2개보다 더 강하기떄문에 많은 수소결합이 있을수록 melting temperature는 더 높아야한다. 따라서 A와 B의 수소결합이 몇개인지 개수를 세어보면 알 수 있다.  1은 10개의 수소결합이, (2x5), 2는 14개의 수소결합이 (3x4+2) 있으므로 2의 경우 denature하기 위해 더 높은 온도가 필요하다.

이렇게 온도에 의해 DNA 선이 붙었다 떨어졌다를 이용해 DNA를 복제할 수 있는데 그 과정을 PCR과정이라 한다.

>> DNA 복제 (PCR 과정) 

DNA 두 가닥이 각각 새로운 가닥을 만들어서 4가닥이 되는게 DNA 복제다. 새로생긴 DNA의 절반은 원래의 것이고 나머지 절반은 새로 만들어진것이기에 DNA 합성을 semiconservative (반보존적인) 복제라고 한다.

PCR을 하기위해 target DNA, DNA polymerase(중합효소), primer(복제 시작지점을 정함), DNA 합성제료인 뉴클레오타이드가 필요하며, 과정으로는 denaturation(열을 가해 수소결합을 끊어 분리시작), Annealing (Primer와 DNA결합), Extension(새로운 DNA 합성과정) 이렇게 세 단계를 거치게 된다. 이걸 반복적으로 했을 경우 DNA가 증폭(양이 많아짐)되기 때문에 아주 소량의 DNA라도 유전자 검출이 가능하다! 

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